作者：韩振格，乔伟振，张敏，孙艳雯，董晨，孟继鸿
【摘要】 目的：表达和纯化丙型肝炎病毒（HCV）?Core、NS3和NS4的His融合抗原H?C、H?NS3和H?NS4，并初步探讨其在抗体检测中的应用。方法：用重组基因工程技术，构建3种重组质粒C?pET?28a?c(+)、NS3?pET?28a?c(+)和NS4?pET?28a?c(+)以及相应的工程菌；质粒经双酶切、PCR和测序鉴定正确后，IPTG诱导抗原表达，从IPTG使用浓度、诱导温度与时间3个方面优化抗原表达条件；用NTA柱纯化抗原后，分别用单片段重组抗原和混合抗原以酶联免疫吸附试验（ELISA）检测100份HCV抗体阳性血清和40份健康人血清。结果：用单片段重组抗原和混合抗原检测的100份HCV抗体阳性血清中，H?C、H?NS3和H?NS4的抗体阳性率分别为91%、75%和52%，而H?C、H?NS3和H?NS4混合抗原的抗体检出率为100%；检测40份健康人血清，结果全部为阴性。结论：HCV不同编码区单片段His融合抗原具有不同的抗体检出率，但均低于混合抗原的阳性率；在开发HCV抗体诊断试剂时，应采用HCV混合抗原。
【关键词】 丙型肝炎病毒； His融合抗原； 抗原纯化； 表达
常用的HCV感染诊断方法主要是用ELISA检测抗?HCV。目前，国内外HCV抗体检测试剂均已开发了3代产品，其包被抗原大多采用基因工程抗原〔1?2〕，主要包括HCV?Core、NS3和NS4。虽然现在普遍应用的第3代ELISA检测试剂的质量较前两代有了很大提高〔3〕，但仍存在一定程度的假阳性和漏检〔4?8〕，如何提高HCV抗体ELISA检测试剂的质量是一个亟待解决的问题。而探索和开发更好的HCV抗原，是完善抗体检测试剂盒的关键。我们在以往研究HCV重组抗原〔9?10〕的基础上，应用基因工程的方法，表达和纯化HCV His融合抗原H?C、H?NS3和H?NS4，用血清学方法对其抗原性进行了初步鉴定，为进一步研制高质量的HCV抗体检测试剂奠定基础。
1 材料和方法
1.1 重组质粒的构建与鉴定
以3种重组质粒C?pGEX?4T?2、NS3?pGEX?4T?2和NS4?pGEX?4T?2（美国CDC惠赠）为模板，分别用PCR方法扩增HCV结构与非结构区基因Core、NS3和NS4。PCR扩增条件：94 ℃预变性2 min；然后92 ℃变性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共35个循环；最后一个循环结束后延伸8 min。
PCR产物用3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit（上海申能博彩生物科技有限公司）回收。质粒载体pET?28a?c(+) 和PCR产物分别用BamHⅠ和XhoⅠ酶切；将酶切后的3种PCR产物分别与酶切后的质粒载体pET?28a?c(+) 连接；取5 μl连接产物转化100 μl大肠杆菌DH5α感受态细胞，取100 μl菌液涂布于含硫酸卡那霉素（K+）的LB培养基平板，涂匀后置37 ℃培养过夜。挑取能在 K+LB 培养基上生长的菌落接种K+LB液体培养基，37 ℃震荡培养过夜。用WizardTM Plus Minipreps DNA Purification Systems （Promega）抽提质粒。重组质粒经PCR、双酶切、测序进行鉴定。
1.2 His融合抗原的诱导表达
将鉴定正确的重组质粒[C?pET?28a?c(+)、NS3?pET?28a?c(+)、NS4?pET?28a?c(+)]分别转化大肠杆菌BL21感受态细菌。取100 μl菌液涂布于K+LB培养基平板，涂匀后置37 ℃培养过夜。
挑取在K+LB培养基上生长的菌落接种K+LB液体培养基，37 ℃震荡培养过夜，次日转1 ml过夜培养菌液至100 ml K+LB液体培养基，37 ℃摇床继续培养至OD600 nm=0.6，平均分入5支已高压灭菌的50 ml大试管，再加入IPTG(Sigma) 至终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8及1.0 mmol・L－1，37 ℃继续培养1 h，收集细菌沉淀，SDS/PAGE确定抗原表达量较高时所需较低的IPTG浓度（即适宜诱导剂浓度）；用此浓度IPTG，分别在25、28、30、35及37 ℃ 诱导抗原表达的收集细菌沉淀，SDS/PAGE确定抗原表达量较高时的适宜诱导温度；用适宜IPTG浓度，在适宜的诱导温度下诱导抗原表达0.5、1、1.5、2及3 h，收集细菌沉淀，超声裂解细菌，4 ℃ 10 000 r・min－1离心15 min，分别收集细菌裂解上清和沉淀，SDS/PAGE确定适宜诱导表达时间，了解抗原的表达方式（可溶性/包涵体），初步制定抗原纯化方案。
1.3 His融合抗原纯化
在优化的表达条件下扩大细菌培养，诱导抗原表达，收集细菌沉淀。用50 mmol・L－1 Tris?HCl（pH 8.0）缓冲液（含有1 mg・ml－1溶菌酶、0.2% 脱氧胆酸钠和1 mmol・L－1 PMSF）重悬细菌沉淀，室温放置10 min，超声裂解细菌，裂解后的菌液15 000 r・min－1 4 ℃ 离心30 min，备用。
可溶性抗原纯化：（1）将 NTA树脂（上海申能博彩科技有限公司）装入合适的层析柱，用10倍NTA柱体积的缓冲液A（pH 8.0，50 mmol・L－1 Tris?HCl 缓冲液）清洗树脂；（2）把细菌裂解上清加到NTA层析柱中，流速控制在15 ml・h－1左右，收集漏过部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况；（3）层析柱用5倍柱体积的缓冲液B（用缓冲液A配成5 mmol・L－1 咪唑溶液，pH 8.0）冲洗树脂，流速控制在30 ml・h－1左右；（4）用1.5倍柱体积的缓冲液C（用缓冲液A配成50 mmol・L－1 咪唑溶液，pH 8.0）洗脱两次，流速控制在15 ml・h－1左右，收集洗脱液；再用1.5倍柱体积缓冲液D（用缓冲液A配成80 mmol・L－1咪唑溶液，pH 8.0）洗脱3次，收集洗脱液；（5）用SDS/PAGE确定目的抗原在洗脱液中的分布情况。
包涵体变性纯化：超声裂解后的菌液15 000 r・min－1 4 ℃离心15 min后，弃上清，用缓冲液A配制1 mol・L－1尿素溶液（pH 8.0），洗涤沉淀两次；再用缓冲液A配制8 mol・L－1尿素溶液（pH 8.0），重悬沉淀，室温作用1 h，15 000 r・min－1 4 ℃ 离心30 min，收集上清用于变性包涵体抗原的纯化。包涵体抗原的变性纯化步骤与可溶性抗原相同，但纯化过程中使用的缓冲液A，均换为用缓冲液A配制的8 mol・L－1尿素溶液（pH 8.0），其它试剂含量完全相同。
纯化抗原的浓度测定：用蛋白定量试剂盒 (Coomassie Plus?The Better BradfordTM Assay Kit，PIERCE) 对这3种HCV重组抗原蛋白定量（严格按试剂盒的操作步骤进行）。
1.4 抗原性检测
以单片段重组抗原和混合抗原（3种抗原等摩尔混合）检测临床上收集的100份抗?HCV 抗体阳性血清和40份健康人血清，具体检测步骤为：分别将纯化后的H?C、H?NS3、H?NS4抗原和混合抗原用0.05 mol・L－1碳酸盐缓冲液（pH 9.6）稀释，包被酶标板100 μl・孔－1，4 ℃冰箱放置过夜，用1×PBST洗涤3次；加入HRP标记的羊抗人IgG (Sigma) 100 μl・孔－1，震荡混匀，37 ℃孵育30 min，以1×PBST洗涤5次；分别加入OPD底物液A、B各50 μl・孔－1，显色10 min后，用2 mol・L－1 H2SO4溶液50 μl・孔－1终止反应，用BIO?RAD酶标仪测量 A450 nm/A620 nm。结果判断：计算待测标本孔A450 nm/A620 nm与阴性对照孔平均A450 nm/A620 nm的值(P/N)，P/N≥2.1为阳性〔11〕。