作者：孔亚林，窦科峰，张洪涛，冯全新，张福琴，赵青川
【关键词】共培
cnExpression of RNA editase of mouse lymphocytes in a coculture system
【Abstract】 AIM: To study the expression of RNA editase of mouse lymphocytes under the effect of heterogeneous antigen in a coculture system of mouse spleen cells and human liver cancer cells and to observe the relation between RNA editase and the functional status of lymphocytes by the use of FK506. METHODS: Spleen cells of 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 and 24 h in the coculture system were observed and the expression of RNA editase was detected by semiquantitative PCR and was contrasted with the mouse spleen cells in a singleculture system. The mouse model with the immune system restrained by FK506 was made, its spleen cells were cocultured with stimulated cells and then the effect of FK506 on RNA expression of editase was detected by semiquantitative PCR. RESULTS: ① The lymphocyte survival rate within 24 h in each group reached 70%. ② The expression of RNA editase in the coculture group tended to show a pattern of declining, ascending and declining again, while that in the control group tended to decline constantly until 12 h and then remained at a comparatively low level. ③ FK506 had an obvious suppressive effect on the expression of RNA editase and this effect declined as the coculture time went on. CONCLUSION: The expression of RNA editase becomes active when stimulated by heterogeneous antigen and the expression level is related with the functional status of spleen cells.
【Keywords】 spleen cells；coculture；RNA editase；PCR；FK506; immunosuppressive agents
【摘要】 目的：通过小鼠脾细胞与人肝细胞肝癌细胞共培养，了解在异种抗原刺激下小鼠淋巴细胞RNA编辑酶表达的变化；并且通过免疫抑制药FK506的应用，观察RNA编辑酶与淋巴细胞功能状态的联系. 方法：观察共培养1，2，4，6，8，10，12，16，20及24 h的小鼠脾细胞，用半定量PCR的方法检测RNA编辑酶表达的变化，并以相同时段单独培养的小鼠脾细胞RNA编辑酶的表达情况进行对照；制备免疫功能受FK506抑制的小鼠模型，取其脾细胞与刺激细胞进行相同时段的共培养，用半定量PCR的方法检测FK506对脾细胞RNA编辑酶的影响. 结果： ①各组淋巴细胞的活细胞率24h内都能达到70%；②共培养组RNA编辑酶的表达呈降低后升高、再降低的趋势，对照组呈一直降低、至12 h后维持在较低的水平；③FK506对RNA编辑酶的表达呈现明显的抑制，与共培养组和对照组相比，这种抑制随着共培养时间的延长而减弱. 结论： 脾细胞RNA编辑酶在异种抗原的刺激下表达活跃，其表达的高低与脾细胞的功能状态有关.
【关键词】 脾细胞；共培养；RNA编辑酶；PCR；FK506;免疫抑制剂
0引言
RNA编辑是近年来发现的转录后修饰过程〔1〕，它通过RNA编辑酶（adenosine deaminase acting on RNA,ADAR）对前RNA特异位点修饰，使腺嘌呤核苷转为次黄嘌呤核苷（Adenosinetoinosine，AtoI）. 除了传统的蛋白翻译途径外，RNA编辑可产生蛋白的同功异构体，接受编辑后的RNA翻译产物可能会与基因组编码的基因产物有所不同，从而在蛋白质多样性的形成中发挥重要的作用. 哺乳类目前已经克隆到4种RNA编辑酶〔2-3〕，即ADAR1，ADAR2，ADAR3，ADATs，它们具有相似的催化结构域. 近年来对AtoI RNA编辑的研究多局限于中枢系统，而对ImRNA含量丰富的众多外周组织中的AtoI RNA编辑情况的研究进展较慢. 我们通过研究小鼠淋巴细胞在异种抗原细胞的刺激下和FK506的抑制下ADAR1的表达情况，了解ADAR1与淋巴细胞功能状态之间的关系.
1材料和方法
1.1材料人肝细胞肝癌细胞（HCC）由第四军医大学西京医院肝胆外科实验室保存，BALB/c小鼠30只购自第四军医大学实验动物中心，体质量22~25 g，雌雄不限；淋巴细胞分离液购自上海华精生物高科技有限公司，反转录试剂盒和PCR试剂为Toyobo公司产品，细胞培养采用100 mL/L小牛血清DMEM溶液（Gibco公司产品）.
1.2方法
1.2.1刺激细胞的制备将HCC细胞复苏后培养并传代，调整细胞密度至1×108个/L，把细胞转移至24孔板中，每孔细胞数目大约为105个，培养24 h，使细胞贴壁.
1.2.2淋巴细胞的分离将小鼠断头处死，无菌条件下取出脾组织，用DHanks液冲洗1次，含青霉素、链霉素的双抗溶液冲洗1次，在器皿中磨碎后由不锈钢纱网过滤，将过滤得到的液体以1∶1的比例与淋巴细胞分离液混合，2000 r/min离心25 min后液体分为3层，取中间云雾状细胞层，DHanks液洗1遍，将细胞重悬于含100 mL/L小牛血清的DMEM培养基中，计数后将细胞密度调整为1×109个/L.
1.2.3免疫抑制小鼠淋巴细胞的制备将小鼠在清洁环境下饲养，按照1 mg/（kg?d）的药量，给小鼠灌服FK506，持续7 d，按照上述方法分离淋巴细胞，调整细胞密度至1×109个/L.
1.2.4分组和共培养体系的建立实验设对照组、实验组和免疫抑制组，每组各10只小鼠. 取培养有HCC的24孔板，实验组是将淋巴细胞与刺激细胞按10∶1比例依次混合至A到J孔中，免疫抑制组是将免疫抑制小鼠淋巴细胞与刺激细胞按10∶1比例混合至a到j孔中，轻轻吹吸5min使两种细胞充分接触，对照组是把相同数目的正常淋巴细胞取10份，转移至空白的24孔板中培养，编号1到10. 将所有细胞在37℃，50 mL/L CO2的孵箱中培养，分别在1，2，4，6，8，10，12，16，20及24 h时每组随机取1孔，收集其中脾细胞,台盼蓝排斥实验计算活细胞率后，提取RNA做反转录. 实验重复3次，观察结果.