作者：韦薇，李瑗，苏建家，曹骥，欧超，杨春，班克臣，岳惠芬
【摘要】 目的 探讨GSTA1基因在肝癌形成中的作用。方法 应用RT?PCR方法检测35例AFB1诱发的树?肝癌、癌旁和癌前组织，以及35例人肝癌和癌组织中的GSTA1 mRNA表达情况；应用免疫组化方法检测以上组织的GSTA1蛋白表达情况。结果 树?肝癌组织的GSTA1 mRNA和蛋白表达水平均低于癌旁及癌前组织；人肝癌组织的GSTA1 mRNA表达水平、蛋白阳性表达率和表达综合得分均显著低于癌旁组织(分别为P＜0.001、P＜0.05和P＜0.001)。结论 GSTA1可能是肝癌发生发展的重要相关基因之一；在mRNA水平和蛋白质水平动态观察相关基因在肝癌形成过程中的表达变化有助于阐释肝癌发生的分子机制。
【关键词】 肝癌 谷胱甘肽S?转移酶A1；树?
Abnormal Expression of GSTA1 in Hepatocellular Carcinoma
Key words：Hepatocellular carcinoma; Glutathione S?transferase A1; Tree shrew
我们在用cDNA芯片筛选肝癌相关基因的前期工作中，发现编码α类谷胱甘肽S?转移酶（GSTs）基因的家族成员之一―谷胱甘肽S?转移酶A1（GSTA1）的表达水平在AFB1诱发的树?肝癌形成过程中下调[1]。近年来研究表明，GSTs对肝脏疾病尤其是肝癌的发生、发展及转归有着重要意义，但目前国内外对GSTA1的研究报道尚少。本研究通过检测GSTA1 mRNA和蛋白在AFB1诱发的树?肝癌形成过程中的表达变化情况，并在人肝癌组织中进行验证，探讨GSTA1在肝癌形成中的作用及其机制。
1 材料与方法
1.1 标本来源
1.1.1 动物实验及肝组织标本的获取 购自中科院昆明生物研究所的成年雄、雌性树?随机分为实验组和对照组：实验组（54只）自第1周至第90周喂予AFB1（美国Sigma公司产品）；对照组（12只）按正常饲养方法喂养。实验结束于第165周，实验期间定期对所有动物进行剖腹手术取肝组织活检；动物发生肝癌处死后，取出肝癌和癌旁组织。
1.1.2 人肝组织标本 35例人肝癌组织及相应的癌旁肝组织（距离肿瘤边缘2cm以外）取自广西医科大学附属肿瘤医院1999～2002年肝胆外科手术切除标本。其中男性32例，女性3例；年龄25～70岁，中位年龄47岁。
上述标本均取一部分经液氮速冻后保存于-80℃冰箱待用，其余固定于10%中性福尔马林。
1.2 主要方法
1.2.1 逆转录多聚酶链反应（RT?PCR）及测序 用Trizol试剂（美国Invitrogen公司产品）经一步法提取组织总RNA，再经RT?PCR合成cDNA。以看家基因GAPDH作为内参照。引物由上海生工生物公司合成，各基因的上、下游引物序列如下：
GSTA1：5’TTC AAT GCA CGG GGC AGA AT3’和5’TCA ATC AGG GCT CTC TCC TT3’；扩增片段长度为251bp。
GAPDH：5’TCA TTG ACC TCA ACT ACA TG3’和5’GCA GTG ATG GCA TGG ACT GT3’；扩增片段长度为437bp。
引物先稀释为10pmol/L，再按25ul反应体系进行PCR扩增。反应条件：94℃ 5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min。PCR产物于1.7%琼脂糖凝胶电泳后置于凝胶成像分析系统（美国Bio?Rad公司产品）进行半定量分析。用目的基因和看家基因两电泳条带单位面积内的灰度比值来反映目的基因的相对表达水平。PCR产物的纯化及测序由上海基康生物技术有限公司完成。
1.2.2 免疫组织化学染色 即用型SP试剂盒、内源性生物素阻断试剂盒均为福州迈新生物技术公司产品；兔抗人、兔、大鼠、小鼠的GSTA1多克隆抗体为美国NeoMarkers公司产品。检测树?肝组织的工作浓度为1∶50，人肝组织的工作浓度为1∶150。免疫组化染色程序按试剂盒说明书进行。用PBS代替一抗作阴性对照；人的正常肝组织作阳性对照片。
细胞浆和/或细胞核呈黄色或棕黄色判为GSTA1阳性细胞；阳性细胞率＜5%为阴性表达。将每张切片上阳性细胞的染色强度分为1（±）、2（+）、3（++）和4（+++）级；阳性细胞的百分率分为 I（5%～25%）、II（26%～50%）、III（51%～75%）和IV（＞75%）级。用染色强度级别与阳性细胞的百分率级别的乘积―“免疫组化染色综合得分”来反映该蛋白的表达水平[2]。