作者：罗燕，邵永斌，谷新利，赵宗胜
【摘要】 目的探讨中药复方多糖与各单味中药多糖及其含药血清对小鼠淋巴细胞增殖的影响。方法制备各中药多糖，并分离服用各多糖后的小鼠血清，分别加入到淋巴细胞悬液中，检测小鼠淋巴细胞增殖情况。结果各多糖组和含多糖血清组均能不同程度的促进淋巴细胞增殖，其中复方多糖和含复方多糖血清组最显著。结论血清药理学方法更能真实地反映药物的药理作用；各单味中药多糖对细胞免疫具有协同促进作用。
【关键词】 中药 糖 含药血清 淋巴细胞增殖
Abstract：ObjectiveTo discuss the effect of polysaccharides of traditional Chinese medicine and each single herbal polysaccharide and medicated serum on lymphocyte multiplication of mice.MethodsVarious polysaccharides of traditional Chinese medicines were prepared.After taking various polysaccharides,mouse serum was separated and added into lymphocyte respectively to examine lymphocyte multiplication.ResultsAll of the polysaccharides and medicated serum could increase lymphocyte multiplication,and the total polysaccharide of Chinese herbal recipe and its medicated serum were most remarkable.ConclusionThe serum pharmacology can reflect pharmacological action actually;single herb polysaccharide has the coordination action to the cellular immunity.
Key words：Traditional Chinese medicine; Polysaccharide; Medicated serum; Lymphocyte multiplication
自拟中药复方免疫增强剂由党参、黄芪、当归、熟地等11味中药配伍而成，经临床应用表明该复方对雏鸡有明显增重作用，能显著提高雏鸡成活率和饲料转化率；从该复方中提取的总多糖成分对小鼠免疫功能有显著促进作用〔1，2〕。本实验采用血清药理学方法，培养淋巴细胞，分别加入服用复方多糖和各单味中药多糖后的小鼠血清和各多糖水溶液，进行淋巴细胞体外增殖实验，初步探讨该复方多糖和11味单味中药多糖对机体细胞免疫功能的影响，以及复方多糖与各单味中药多糖之间的关系。
1 材料与仪器
1.1 动物昆明种小鼠，8～12周龄，体重18～25 ｇ，雌雄兼用，购自石河子大学动物养殖中心。
1.2 试剂
MTT、RPMI-1640、标准胎牛血清均购自华美生物工程公司，台?蓝购自北京拜尔迪生物公司。
1.3 仪器酶标仪（BIO-RAD），二氧化碳培养箱（Thermo Forma）。
1.4 药品实验用的中药复方免疫增强剂是由党参、黄芪、当归、熟地、淫羊藿、茯苓等11味中药配伍而成，各单味中药是从石河子医药公司同次购进，按照配伍比例称取各单味药混合后制成复方。中药复方多糖和各单味中药多糖由本院中兽医实验室提供。小鼠口服剂量均指经过换算实际进入小鼠体内纯多糖的含量，各多糖用时用蒸馏水配成0.05%的水溶液（5 mg/ml），115℃,30 min高压灭菌,备用。
2 方法
2.1 水煎剂的制备按照配伍比例称取各单味药混合后制成复方，将复方中药粉碎，充分混匀后称取复方中药7.0 g，加100 ml水煎煮，加热同时不时搅拌，水沸后计时40 min后用纱布过滤，收集滤液，在滤渣中重新加入60 ml水煎煮，水沸后计时30 min，再用纱布过滤弃渣，合并两次滤液，浓缩至140 ml，使每毫升水煎剂中含生药50 mg。
2.2 含药血清的制备〔3，4〕小鼠随机分为14组，每组10只，实验组分别灌服复方多糖、复方水煎剂以及当归多糖、川芎多糖、淫羊藿多糖、麦冬多糖、何首乌多糖、茯苓多糖、补骨脂多糖、熟地多糖、山楂多糖、党参多糖、黄芪多糖等11味单味中药多糖，对照组灌服生理盐水，每天灌服1次（每次0.5 ml/只），连续7 d，小鼠于末次灌胃后1 h摘除眼球取血，无菌分离血清，同组血清混合后经56℃、30 min灭活处理，再用0.45 μm微孔滤膜过滤除菌，置-20℃保存备用。
2.3 实验分组药物组分为复方多糖组、复方水煎剂组和当归多糖组、川芎多糖组、淫羊藿多糖组、麦冬多糖组、何首乌多糖组、茯苓多糖组、补骨脂多糖组、熟地多糖组、山楂多糖组、党参多糖组、黄芪多糖组以及空白对照组，共14组。
含药血清组也分为14组，即复方多糖药物血清组、复方水煎剂药物血清组、当归多糖药物血清组、川芎多糖药物血清组、淫羊藿多糖药物血清组、麦冬多糖药物血清组、何首乌多糖药物血清组、茯苓多糖药物血清组、补骨脂多糖药物血清组、熟地多糖药物血清组、山楂多糖药物血清组、党参多糖药物血清组、黄芪多糖药物血清组和空白血清对照组。
2.4 淋巴细胞增殖试验〔5,6〕颈椎脱臼处死小鼠，无菌取出小鼠脾脏。200目滤网上捻碎，RPMI-1640液冲洗，收集含脾细胞的冲洗液，1 500 r/min离心5 min。去上清后加入预冷的0.83%Tris-NH4Cl裂解红细胞1 min，重复裂解一次，再用1640培养液洗2～3次，弃上清，混匀。台?蓝染色检测后，用含10%小牛血清的RPMI-1640完全培养液（含100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素）将脾细胞数调整为6×106个/ml的细胞悬液。于96孔平底培养板中每孔加入100 μl细胞悬液，试验组加中药多糖或含药血清，对照组加培养液，每孔做3个重复孔。37℃，5%CO2的培养箱中培养72 h，于终止培养前4 h，每孔加入10 mg/ml MTT溶液10 μl，继续培养4 h，培养结束后仔细弃去上清，每孔加酸化异丙醇100 μl，充分振荡吹打后静置20 min，用检测波长570 nm参考波长630 nm比色分析，用OD值表示结果。
2.5 统计学分析所有数据均用SPSS13.0统计学软件处理，组间差异比较采用单因素方差分析。
3 结果
3.1 药物组对淋巴细胞增殖的影响
3.1.1 13个药物组与空白对照组比较，见表1。表1结果表明，13个药物组均能不同程度地增强小鼠淋巴细胞增殖反应，其中复方多糖对淋巴细胞增殖的促进作用最强，与对照组比较差异极显著（P0.01）；而山楂多糖组和党参多糖组对小鼠脾淋巴细胞体外增殖的促进作用相对较弱，与对照组比较差异显著（P0.05），其它11个药物组对小鼠脾淋巴细胞体外增殖具有较强的促进作用，均与对照组间差异极显著（P0.01）。
根据表1结果，13个药物组对小鼠淋巴细胞的增殖的促进作用强弱顺序依次为：复方多糖>复方水煎剂>黄芪多糖>淫羊藿多糖>茯苓多糖>当归多糖>补骨脂多糖>麦冬多糖>川芎多糖>熟地多糖>何首乌多糖>山楂多糖>党参多糖。
3.1.2 复方多糖组与复方水煎剂、单味药物多糖组比较见表1。表1结果表明，与复方水煎剂组和11个单味中药多糖组比较，复方多糖组对小鼠淋巴细胞增殖的促进作用较强，优于复方水煎剂组，与之产生显著性差异(P0.05)；明显优于其它11个单味中药多糖组，与这11组均产生极显著性差异(P0.01)。
3.1.3 复方水煎剂组与11个单味药物多糖组比较见表1。表1结果表明，与组成复方的11个单味中药的多糖组比较，复方水煎剂组对小鼠淋巴细胞增殖的促进作用较强，优于黄芪多糖组，与黄芪多糖组产生显著性差异（P0.05），显著优于其余10组，与其它10个单味中药多糖组均具有极显著性差异（P0.01）。