摘要: 细胞壁的屏障作用是微生物降低对消毒剂敏感性的普遍机制。消毒剂对细胞膜的作用导致膜的通透性增加, 胞内物质泄漏, 呼吸链被破坏等。一些消毒剂能直接改变、破坏蛋白质和核酸的结构和功能, 但核酸和蛋白质的合成过程可能比结构本身对消毒剂更加敏感。流式细胞仪、单细胞凝胶电泳等新技术的应用将使人们能够更深刻地了解消毒剂的作用机理。
关键词: 化学消毒剂, 作用机理, 细胞膜, 蛋白质, 核酸
近年来, 开发应用于消毒的化学物质单体及其复配制剂不断增多。由于微生物对消毒剂抗药性日益严重以及人们健康环保意识的不断增强, 开发高效低毒的消毒剂产品是未来的发展趋势, 因此, 须从机理上去阐明各种消毒剂对微生物的致死作用。国内外研究者从细胞壁、细胞膜、细胞质、核酸以及细胞的物质能量代谢等不同层面和角度进行消毒机理的研究, 取得了相当的进展。
1 消毒剂对微生物细胞壁的作用
细胞壁的屏障作用是微生物降低对药物敏感性的普遍机制, 特别是分支杆菌、革兰氏阴性细菌及芽孢。具体而言, 细菌细胞壁中的肽聚糖, 真菌的葡聚糖、甘露聚糖,芽孢外壁中的吡啶二羧酸, 分支杆菌中分枝酸的含量等都对消毒剂的吸收和透过具有重要影响, 甚至培养基的构成也会影响到微生物对消毒剂的敏感性[ 1 ] 。Fraud等人的研究表明, 分支杆菌的原生质体对邻苯二甲醛、戊二醛及双氯双胍乙酸的敏感性均比非原生质体显著增强, 可能是失去细胞壁后细胞表面的疏水性下降所致[ 2 ] 。Hiom等人发现酿酒酵母(Saccharom yces cerevisiae) 细胞壁的厚度、孔密度及葡聚糖含量影响其对双氯双胍己烷(Chlorhexidine, CHX) 的敏感性, 但与甘露聚糖的含量无关。随着细胞壁的孔密度降低或厚度增大, 细胞对CHX的吸收量下降[ 3 ] 。通常认为消毒剂是以被动扩散的方式经过葡萄球菌的细胞壁, 对于其它革兰氏阳性菌则所知甚少。革兰氏阴性菌的细胞壁外层为脂多糖、磷脂和脂蛋白组成的外膜, 亲水性和亲脂性消毒剂分别由外膜上的亲水性和亲脂性孔道进入。阳离子消毒剂可通过对外膜的破坏而使自身的被动吸收量提高, 如双胍类、季铵盐类等。
细菌芽孢的外壁因富含吡啶二羧酸而难以被杀灭。研究发现枯草芽孢杆菌营养细胞对戊二醛的吸收量大于萌发中的芽孢, 而休眠的芽孢其吸收量最小。另外, 氯比碘更能有效杀死枯草芽孢杆菌的芽孢, 可能是因为该芽孢对氯的吸收比对碘的吸收快。虽然很少有消毒剂把真菌细胞壁作为主要的作用靶点, 但几丁质是一个潜在的交联剂(甲醛和戊二醛) 作用位点。
2 消毒剂对微生物细胞膜及胞内物质的作用
细胞膜在维持微生物的正常生命活动中具有非常重要的地位。对于细菌而言, 细胞膜不仅保持胞内物质与外界的隔离性, 而且是物质与能量代谢的场所。消毒剂对细胞膜作用的表现为膜的通透性增加, 胞内物质泄漏, 呼吸链被破坏, ATP的合成减少或停止, 糖酵解终止等。这些作用均可导致细菌的死亡。
2.1 对膜的作用 生物的细胞膜主要由磷脂双分子层和蛋白质构成, 两者都可以成为消毒剂分子作用的目标。双胍类和季铵盐类一般是以膜上的磷脂分子作为作用靶标而造成各种微生物细胞膜的损伤。多聚双胍类使大肠杆菌( Escherichia coli) 的内膜产生脂相分离和产生酸性磷脂。过氧化氢产生的羟自由基能氧化酶和蛋白的巯基, 也常常攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸(当然还有其它作用) 。通常, 很多消毒剂都能与蛋白质和酶上的巯基发生作用, 使膜蛋白受到破坏。
K+泄漏是膜受到损伤的直接证据之一[ 4 ] 。K+非常迅速地从受损细胞中释放出来,并且可以方便地用原子吸收分光光度计、K+选择性电极、电感耦合等离子质谱仪等检测, 已有多种消毒剂作用于微生物导致K+泄漏的报道。
原生质体裂解作用是确认消毒剂对细胞膜损伤作用的另一个好方法。相对“正常”细胞, 原生质体受到消毒剂攻击时更容易裂解。不同消毒剂对同一种原生质体破坏程度不同, 同一种消毒剂对不同种原生质体的作用程度也有差异。Caroline 发现Polyquaternium - 1 ( PQ - 1, 一种季铵盐类化合物) 能有限破坏粘质沙雷氏菌(Serratiam arcescens) 的细胞膜, 但不能裂解白色念珠菌(Candida albicans) 的原生质体, Myris-tamidop ropyl dimethylamine (MAPD, 一种氨基胺) 也只能导致白色念珠菌部分裂解; 但PQ - 1和MAPD都能杀灭白色念珠菌, 且都能导致K+泄漏。也许它们对膜的损伤只导致K+的泄漏而没有达到使原生质体裂解的程度。但PQ - 1和MAPD都能很好地裂解粘质沙雷氏菌的原生质体。由此看来有些消毒剂对膜的损伤很有限[ 5 ] 。
此外, 测定ATP、磷酸盐的泄漏, 以及细胞对某些物质的吸收速率也是证明膜受损的有效方法。但是, 对膜损伤的研究不应仅仅停留在测定胞内物质泄漏以及外膜裂解的层面上。特别是真核生物, 其内膜体系与生命的关键代谢戚戚相关, 研究消毒剂如何作用于真核生物的内膜系统, 将使我们能够更深入地了解真核生物的消毒机理。
2.2 对代谢的影响 维持生命活动的重要代谢活动包括糖酵解、三羧酸循环、呼吸链(电子传递链) 、氧化磷酸化(ATP的生成) 、核酸和蛋白质的合成等。这几个重要代谢活动中的任何一个被终止都可能导致生命活动的停止。物质能量代谢成为研究消毒机理更为深层次的问题。
膜的完整性受到破坏后, 其通透性增加, 胞内的物质会往外泄漏, 这其中包括代谢中间产物及催化有关反应的酶。Iwami[ 6 ]的研究显示, 洗必泰作用后链球菌突变体NC IB11723的糖酵解速率下降, 但这种下降主要是由于酵解中间产物的泄漏引起的。
呼吸被抑制的重要标志是ATP合成量的减少。原核生物的呼吸链位于细胞膜上,消毒剂与膜的接触可破坏呼吸链, 导致ATP合成下降或受阻, 造成细胞死亡。Dinning等[ 7 ]用虫荧光素- 虫荧光素酶生物发光法测定并发现亚抑制浓度的羟基吡啶硫酮就能使胞内ATP水平大幅度下降。刘雪林等发现二氧化氯作用30 s后大肠杆菌的ATP酶活性下降显著。
W illiams[ 8 ]发现3 - 氯- 4, 4 - 二甲基- 2 - 恶唑烷酮和1, 3 - 二氯- 4, 4, 5, 5- 四甲基- 2 - 咪唑烷酮对金黄色葡萄球菌的K+泄漏和H+通透性增加作用不大, 但细胞的耗氧量减少, 可见抑制呼吸酶是这两种抑菌剂作用的第一步, 并最终会导致微生物失活。
目前对呼吸抑制作用的证据主要是氧消耗(或吸收) 的减少或ATP合成水平下降等间接指标。但消毒剂具体作用在呼吸链上的哪一个环节或哪一种酶还难以确定, 也许是这些酶难以分离纯化阻碍了这方面的研究。真核生物的呼吸链位于线粒体内膜上,其呼吸链与消毒剂接触的难度比原核生物大, 因此消毒剂对它的能量代谢的作用机制可能更复杂些。
脂肪酸含量变化也被用来分析消毒剂的作用机理。Triclosan是一种膜作用剂, 但研究显示其对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌及其它细菌的生长抑制作用主要是因为依赖于NADH的脂酰- ACP转移还原酶被抑制, 造成脂肪酸合成被停止。刘雪林发现大肠杆菌被二氧化氯杀灭与脂质被氧化有关。另外, 碘类消毒剂、过氧乙酸等也对细胞膜上的脂肪酸发生作用。